CYP450酶代謝表型研究原理及實驗方法

1 概述

1.1 藥物代謝研究簡介

藥物代謝研究是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要內(nèi)容，它不僅決定了創(chuàng)新藥物制劑研發(fā)的成敗，而且與創(chuàng)新藥物研發(fā)的速度和質(zhì)量有密切關系。因而，藥物代謝研究在新藥研發(fā)工程中具有*的重要作用，研究藥物代謝對于了解藥物在體內(nèi)的變化過程至關重要。

藥物代謝研究的方法主要分為體內(nèi)和體外兩種。體內(nèi)代謝法因藥物在生物體內(nèi)的分布較廣，加上代謝轉(zhuǎn)化的器官和酶系的多樣性，使藥物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的濃度比較低，代謝產(chǎn)物的檢測具有一定的困難。體外代謝法在短時間內(nèi)可以得到大量的代謝產(chǎn)物，且代謝條件可控，代謝體系比較“干凈"，代謝物易于分離、提取，有利于代謝途徑研究及代謝產(chǎn)物結(jié)果的確定等，因而，體外代謝法具有突出的*性。

由于肝臟是藥物代謝的主要場所，體外代謝模型多以肝臟為基礎。目前，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體體外溫孵法、重組P450酶體外溫孵法、肝細胞體外溫孵法、肝臟離體灌流法和肝切片法。其中，肝微粒體體外溫孵法與其他體外代謝方法相比，酶制備簡單，代謝過程快，重現(xiàn)性好，易大量操作，同時可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究，因而在實際工作中應用較為普遍。

1.2 CYP450酶代謝表型研究的意義

為獲得更好的治療效果，聯(lián)合用藥在臨床治療中已非常普遍。然而，在獲得更好的療效的同時，常伴隨著由藥物-藥物相互作用（drug-drug interaction，DDI）引起的不良反應事件的發(fā)生。如特非那丁與酮康唑合用時，酮康唑可顯著地抑制特非那丁的代謝，造成特非那丁的血藥濃度顯著升高，可以導致致命的室間心律失常。因此，在新藥臨床前研究中，對藥物的代謝酶表型進行鑒定，獲得其主要代謝酶的消除比例，闡明參與藥物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的相關酶亞型，對于研究藥物的代謝機制，預測藥物代謝多態(tài)性和藥物間相互作用等方面具有重要意義。

藥物代謝酶表型鑒定，主要是研究參與藥物清除的代謝酶的類型、數(shù)量和相對貢獻率。如果藥物主要通過單一的代謝途徑對藥物進行清除，可能會存在很大的用藥風險；相反，如果某一藥物的代謝過程涉及的代謝酶越多，則說明其代謝途徑也越多，也就難以發(fā)生潛在的藥物-藥物相互作用，使得患者之間的治療偏差降低。

北京匯智泰康生物技術有限公司針對CYP450酶代謝表型研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導，以化學抑制法為基礎，開發(fā)了一款專門用于CYP450酶代謝表型研究的試劑盒，該產(chǎn)品可直接用于藥物CYP450酶代謝表型研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程，大大縮短了實驗周期，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，符合CYP450酶代謝表型研究試驗要求，實驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性好。

圖1為采用肝微粒體技術研究西尼地平與幾種臨床常用藥物間的代謝相互作用的實例，結(jié)果表明環(huán)孢素、紅霉素和辛伐他丁在體外表現(xiàn)出對西尼地平代謝的抑制作用，由于三者均是CYP3A的抑制劑或底物，這提示西尼地平與CYP3A的抑制劑或底物合用時可能會出現(xiàn)代謝上的相互作用，使西尼地平的代謝速率降低，西尼地平二氫吡啶環(huán)脫氫代謝物生成減少，而原型藥物的水平顯著提高，這可能會影響臨床療效的正常發(fā)揮。

圖1 人肝微粒體中幾種臨床常用藥物對西尼地平代謝的影響

如果合用的藥物具有潛在的抑制或誘導代謝酶的能力，則前者將受到合用藥物的影響，從而使其代謝清除途徑發(fā)生量化的改變，這種藥物相互作用可能會影響治療效果，增加藥物的治療失敗率，甚至誘發(fā)不良反應。因此，通過對代謝酶表型的體外研究來判定該化合物的主要代謝酶亞型，已成為藥物臨床前代謝研究工作中*的一部分。

1.3 CYP450酶及代謝表型研究方法

CYP450為一類含亞鐵血紅素蛋白的超家族，根據(jù)相關酶亞型在藥物代謝中的重要程度，可將CYP450分為以下三類：（1）主要CYP450，包括CYP1A2、CYP2C9 、CYP2C19 、CYP2D6 和CYP3A4；（2）較主要CYP450，包括CYP2B6、CYP2C8和CYP3A5；（3）次要CYP450，包括CYP1A1、CYP1B1、CYP2A6、CYP2E1、CYP2J2和CYP4A11等。參與藥物代謝的動物肝微粒體P450酶較為復雜，而人肝微粒體中參與藥物代謝的P450酶相對比較簡單，主要有CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E和CYP3A，其組成見圖2。

圖2 人肝內(nèi)P450酶的組成

目前，CYP450的酶表型鑒定主要使用以下3種方法：選擇性抑制法、重組人源CYP450同工酶法、相關性分析法。選擇性抑制法又分為化學抑制法和抗體抑制法，即在加入和不加入一系類CYP450酶亞型選擇性化學抑制劑或抗體的條件下，分別測定人肝微粒體對藥物的代謝活性，以考察人肝微粒體中CYP450酶亞型倍選擇性抑制后，藥物的代謝是否受到影響，從而計算相對抑制百分率，推斷CYP450酶代謝表型。其中，化學抑制法由于其操作簡單，且價格低廉而得到廣泛應用。

2 實驗原理

參與藥物代謝的CYP450酶主要為CYP1、CYP2和CYP3三個家族，共有7種重要的亞型，分別為CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4；

α-奈黃酮為CYP1A2的特異的選擇性抑制劑，毛果蕓香堿為CYP2A6的特異的選擇性抑制劑，噻氯匹定為CYP2C19的特異的選擇性抑制劑，奎尼丁為CYP2D6的特異的選擇性抑制劑，二乙基二硫代氨基甲酸鈉為CYP2E1的特異的選擇性抑制劑，酮康唑為CYP3A4的特異的選擇性抑制劑，磺胺苯吡唑為CYP2C9的特異的選擇性抑制劑，如選用特異的選擇性抑制劑抑制不同亞型的酶的活性，便可研究藥物的CYP450酶代謝表型。

3 實驗方法描述

肝微粒體體外溫孵法是采用肝微粒體，輔以NADPH再生系統(tǒng)，在體外模擬生理環(huán)境條件進行代謝反應，經(jīng)過一定時間的反應后，采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測定溫孵液中原型藥物和其代謝產(chǎn)物，并對代謝產(chǎn)物進行初步的分析和鑒定的方法。

3.1 肝微粒體制備

P450酶主要在肝臟中表達，肝臟中的P450酶在體外是以微粒體的形式存在的。微粒體是指在細胞勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，是異質(zhì)性的集合體。它包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分，在體外實驗中具有蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)糖基化和脂類合成等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本功能。目前，制備肝微粒體常用的方法是差速離心法。具體制備流程見下圖（圖3）：

圖3 肝微粒體制備流程圖

3.2 體外孵育體系的建立

CYP450酶代謝表型研究的肝微粒體體外孵育體系，是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，再加入酶特異的選擇性抑制劑，在模擬生理溫度及生理環(huán)境的條件下進行生化反應的體系。

推薦使用的孵育體系為：每個孵育體系總體積為200 µL，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液，匯智泰康NADPH發(fā)生系統(tǒng)（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，3.3 mM的氯化鎂）；0.5 mg/mL的肝微粒體蛋白；適量的選擇性抑制劑；合適濃度的待測物，于37°C水浴孵育，每個樣品平行3次，以不加選擇性抑制劑組為對照。于預設的反應時間點，加入等體積預冷的乙腈終止反應。

3.3 原型藥物或代謝產(chǎn)物的檢測

采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測定溫孵液中原型藥物或其代謝產(chǎn)物的濃度。

例：

下圖（圖4、圖5、圖6）為研究某一候選藥物的CYP450酶代謝表型的實驗，該實驗采用選擇性化學抑制劑的方法分析了該藥物在鼠、犬和人肝微粒體中的代謝情況，從而判斷微粒體中哪些CYP450亞型是該藥物的主要代謝酶。

數(shù)據(jù)計算：

用待測物的消除速率表示待測物在微粒體孵育體系中的代謝速率。

抑制率%=（1- 加入抑制劑樣品代謝速率/空白對照樣品代謝速率）×100%

圖4 大鼠肝微粒中某藥物的代謝抑制率

圖5 犬肝微粒中某藥物的代謝抑制率

圖6 人肝微粒中某藥物的代謝抑制率

從上圖可知，不同種屬微粒體中，該候選藥物的代謝抑制率存在差異。表明，不同種屬微粒體中參與該候選藥物代謝的酶亞型可能不同。

4 本公司CYP450酶代謝表型研究試劑盒簡介

北京匯智泰康生物技術有限公司針對CYP450酶代謝表型研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導，以化學抑制法為基礎，開發(fā)了一款專門用于CYP450酶代謝表型研究的試劑盒，該產(chǎn)品可直接用于藥物CYP450酶代謝表型研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程，大大縮短了實驗周期，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，符合CYP450酶代謝表型研究試驗要求，實驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性好。

4.1 產(chǎn)品說明

本產(chǎn)品提供了CYP450酶代謝表型研究用到的肝微粒體、NADPH再生系統(tǒng)、酶特異性抑制劑及其它組分，可直接用于藥物CYP450酶代謝表型研究。本產(chǎn)品可提供肝微粒體有：人肝微粒體、恒河猴肝微粒體、比格犬肝微粒體、大鼠肝微粒體和小鼠肝微粒體，可根據(jù)實際需求，選擇不同種屬的肝微粒體。

4.2 試劑盒優(yōu)勢

便捷——本試劑盒省去了肝微粒體制備和試劑配制時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。

準確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，實驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性高。

穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強、易于運輸和保存。

4.3 產(chǎn)品組成

50反應/盒，200μL/反應。

4.4 產(chǎn)品使用說明

本產(chǎn)品需于-70℃冰箱冷凍保存，切記避免反復凍融。試驗具體操作如下：

4.4.1 試驗組

1）冰浴融化試劑盒各組分，置于冰上待用；

2）除微粒體外，將孵育體系其它各組分按照配比混合并吹吸混勻，于37℃預孵育5min；

例：200μL孵育體系配制：

注：a.體系中有機溶劑加入量不得大于1%。

b.若實際需要n個孵育體系，則需配置n＋1個體系。

3）將以上混合液195μL/管分裝至1.5mL離心管中，于37℃水浴中保溫， 5μL/反應加入肝微粒體，吹吸3次混勻于37℃水浴條件下啟動代謝反應，使用秒表計時；

4）于設定孵育時間點，向孵育體系中加入200μL預冷的乙腈終止反應（預冷乙腈：孵育體系體積=1:1）。

4.4.2 對照組

1）加陽性底物組：反應體系中不加選擇性抑制劑，并將受試物換為陽性底物，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補齊；

2）無抑制劑組：反應體系中不加選擇性抑制劑，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補齊；

3）無A液、B液組：反應體系中不加A液和B液，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補齊。

4.4.3 結(jié)果判定

   CYP450酶亞型與選擇性抑制劑對應一覽表。

4.5 運輸條件

干冰運輸。

4.6 注意事項

1.試驗開始前，請自行準備1.5mL離心管、不同規(guī)格槍頭、乙腈、37℃水浴鍋等。

2.本產(chǎn)品僅供科研使用，不能用于人體及動物的治療或臨床診斷。

3.使用前，需于冰浴條件下解凍并混合均勻。

4.于-70℃冰箱冷凍保存，切勿反復凍融。

5.在使用過程中，也可根據(jù)實際實驗需求調(diào)整各組分的加入量。